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浅谈凯氏定氮法测定蛋白质的原理及注意事项

发布时间:2015-10-10      点击次数:13751

    蛋白质测定zui常用的方法是凯氏定氮法,它是通过测定氮含量从而换算成蛋白质的方法,是上通用的标准方法,其优点为实验操作简单、方便,测量结果的重复性和重现性好,而被广泛应用于各类食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定中。凯氏定氮法分为常量、半微量、微量法三种方法,其原理是食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质的含量。该方法有取样、样品消化、蒸馏、滴定四个步骤,其原理较为复杂,使用的试剂也比较多,以下将对这四个步骤进行简单讲述。

1 样品的取样


取样应具有代表性,取样前将样品充分混匀,固体试样可用粉碎设备制成细小均匀粉末。称量放入凯氏定氮瓶时,切勿使样品粘附在瓶颈部,避免样品未消化完全而造成氮损失。


2 样品的消化


样品中含氮有机化合物经硫酸在加热的条件下消化,硫酸的作用促使有机物脱水炭化。含氮的有机物炭化并生成碳,碳在将硫酸还原为二氧化硫的反应中,自身则被氧化成为二氧化碳;反应过程中产生的二氧化硫将氮还原为氨气,此过程中其自身则被氧化成三氧化硫;而消化过程生成的氢,又加速了氨的形成。生成的水以水蒸气的形式连同反应过程中生成的三氧化硫一同逸出,而氨气则以硫酸铵的形式留在消化液中。


化学反应方程式为:


2NH2(CH2)2COOH+13H2 SO4→(NH4)2SO4+CO2↑+SO2↑+16H2O


此过程的注意事项:①样品消化时,对于含糖量很高或含脂量较多的样品,应注意要缓慢升温加热,并随时注意控制加热的温度,避免产生大量泡沫喷出或喷溅到瓶壁上,造成样品的损失。若因加热温度不当,局部温度过高使消化液喷溅到瓶壁上,应及时转动凯氏定氮瓶将溅到瓶壁上的样品消化液冲下,也可在样品消化前加入少量辛醇或液体石蜡,以减少泡沫的产生。②消化时应不定时旋转凯氏定氮瓶,将附在瓶壁上的碳粒冲下,使样品充分消化。③若样品难以消化至澄清透明的程度,可将凯氏定氮瓶从加热器上取下,待其中溶液冷却至室温后,向消化液中加入少量过氧化氢,再继续加热直至完全消化。④整个消化过程中硫酸的量要充足,以保证样品中含氮有机化合物的彻底消化。样品中脂肪含量过高时,要增加硫酸的量,因消化时脂肪消耗硫酸的量较大,使硫酸缺少而影响测定。⑤在样品消化末期,即消化液呈蓝绿色并澄清透明后,再继续加热半小时即可,因此时瓶内消化液温度过高,若长时间加热,会使生成的硫酸氢铵分解并释放出

氨气,使氮的含量损失,从而影响测定结果。


3 蒸馏


化学反应方程式为:


(NH4)2SO4+NaOH→Na2SO4+NH3↑+H2O


注意事项:①水蒸气发生器中的水要呈酸性,因水中可能含有微量的氨离子,防止其受热溢出而影响测定结果。②蒸馏反应过程中,硫酸铵为强酸弱碱盐,可使消化液为弱酸性溶液。为保证测量结果的准确性,务必使结合态的氨能完全反应并释放出来,因此整个蒸馏过程中,碱液的量不足,酸碱中和反应则不彻底,很难达到使氨充分分离的目的,从而使测量结果不准确。氢氧化钠溶液既能中和样品消化液中过量的酸,又可为氨的有效分离提供一个碱性环境,因此氢氧化钠的用量要控制适当。实验者可利用消化液中含有的铜离子,根据其特征颜色作为碱性反应的指示剂。当反应室内加入氢氧化钠溶液后,其溶液颜色立即变为蓝黑色时,表明氢氧化钠已过量,能达到酸碱反应的要求,可保证反应完全进行。③加氢氧化钠的漏斗要采用水封,避免因蒸馏装置漏气造成氨的溢出而影响测定结果。


4 滴定


氨以气体的形式被释放出来,用硼酸溶液吸收后,使用盐酸或硫酸标准滴定液进行酸碱滴定,从而计算出样品中蛋白质的含量。此过程的注意事项:①硼酸吸收液的温度不宜过高,过高则氨的吸收能力将减弱,会影响测量结果,使结果偏低。方式是保持溶液温度在20℃以下,或将接收瓶置于冷水浴中。②硼酸吸收液的体积不使用精密量取,只要保证能将氨全部吸收即可,因为硼酸的酸性很弱,不会影响滴定。③滴定用的标准滴定液必须按照要求进行配制和标定,因其准确度直接影响测量结果的准确性。④计算蛋白质的含量时须乘以氮换算蛋白质的系数,一般食物为6.25。


5 小结


新鲜食品中的含氮化合物大都以蛋白质为主体,所以检验食品中的蛋白质含量时,只限于测定总氮量,然后乘以蛋白质换算系数6.25,即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动、植物食品的蛋白质含量测定,因样品中常含有核酸、生物碱等以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物,所以该法测定结果为粗蛋白质含量。笔者通过参加国家机构组织的“食品中蛋白质的测定"能力检验证,以反复实验为基础,在实验过程中摸索可能影响实验结果的关键点和注意事项,严格把握实验原理,多次推敲与总结,得到上述实验经验。


参考文献


[1] 马丹.凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量[J].计量与测试技术, 2008,35(06):57-58. 


[2] 王燕.食品检验技术(理化部分)[M].1 版.北京:中国轻工业出版社,2012:102-110. 


[3] 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典[M].1 版.北京:中国医药科技出版社,2010:53. 


[4] 张朝武.现代卫生检验[M].1 版.北京:人民卫生出版社,2005: 24-56. 


[5] 中国药品生物制品检定所,中国药品检验总所.药品检验仪器标准操作规程[M].1版.北京:中国医药科技出版社,2010:181-183.

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